二甲基亚砜（DMSO）是一种重要的极性、非质子分子，在室温下为透明无色液体。除了在化学反应中的应用外，DMSO还经常用作溶剂。因为它具有两亲性，所以也被用来溶解小分子疏水性药物。同时DMSO因其膜渗透能力而被广泛用作细胞和组织的冷冻保存剂。由于DMSO可以调节膜的通透性，通过细胞膜的更高渗透性对DNA质粒的更高摄入有助于提高蛋白质的表达量。

　　在这项研究中，作者研究了DMSO是否会使HEK-293细胞的转染效率提高。如果是这样，可以进一步确定DMSO的最佳浓度和最佳时间，以在不引起细胞毒性的情况下提高转染效率。DMSO在活细胞中的浓度越高和/或时间越长，可能对细胞的毒性也越强，因为DMSO会降低膜的刚性，在高浓度下，它甚至会诱导膜中的孔形成。HEK-293细胞是表达重组蛋白的常用细胞系。与其他哺乳动物细胞（如CHO细胞）相比，HEK-293细胞可以有更高的转染效率和正确的翻译。HEK-293细胞中的蛋白质表达很快，通常在48小时内达到峰值。蛋白质的高表达对于单细胞水平的膜蛋白研究至关重要。因此，提高重组蛋白在HEK-293细胞中的表达效率仍然是一个重大的挑战。

　　以下实验研究了将DMSO孵育HEK-293细胞是否会导致转染效率和表达量的提高。作者将瞬转的GFP作为标记蛋白，这样就可以通过测量表达GFP的细胞或绿色细胞的百分比来确定瞬转效率。作者还检测了细胞数量随时间的变化，以便可以监测DMSO对细胞的任何潜在损伤。最后，作者选择了磷酸钙方法用于HEK-293细胞的瞬时转染。虽然市场上有许多基于脂质体的转染试剂，但磷酸钙方法仍然是一种简单、有效和廉价的转染培养真核细胞的方法。它已被广泛用于许多贴壁和非贴壁细胞的转染。

　　结果

　　DMSO的作用

　　为了研究DMSO对HEK-293细胞中重组蛋白瞬时表达的影响，首先转染GFP。与对照组（图1A，右图）相比，转染4小时后将DMSO置于转染的细胞培养液中似乎增加了绿色细胞的数量（图1B，右图。如图所示，与未处理的培养皿相比，从DMSO处理的培养皿中发现了更多的绿色细胞或更亮的绿色细胞（图1C及其图例）。细胞在用GFP质粒转染后4小时加入DMSO。通常，作者会将转染溶液铺在细胞上，然后将培养液放回37℃的培养箱中。4小时后，将转染溶液替换为正常或完全生长培养基。作者尝试将DMSO与转染溶液混合，并将混合物加入细胞中。然而，将转染溶液和DMSO的混合物加入细胞中后，发现活细胞数量大大减少，这可能是因为将DMSO孵育4小时会对细胞产生毒性。此外，作者发现将DMSO与转染溶液混合会导致混合物中出现一些沉淀。因此，作者决定在细胞用DMSO处理之前等待4小时。换句话说，转染4小时后，作者将从培养箱中取出转染的培养皿进行培养基更换；此时首先用PBS洗涤培养皿，然后用DMSO处理。DMSO处理后，再次用PBS洗涤培养皿，并在将其放回培养箱之前补充正常生长培养基。

　　图1:DMSO对HEK-293T细胞中GFP瞬转表达的影响。

　　最佳DMSO浓度和赋予时间的研究

　　接下来，作者尝试确定DMSO处理转染的HEK-293细胞的最佳浓度和最佳时间。这些实验很重要，因为DMSO在更高浓度或更长的时间作用下会损伤细胞。众所周知，即使在较低浓度下，DMSO对细胞的长期作用也可能具有细胞毒性。为了确定最佳的DMSO浓度，作者在PBS中测试了4种不同浓度的DMSO，范围从5%到20%（v/v的%；图2），持续5分钟，以及对照或未处理的培养皿（即仅用PBS缓冲液处理的培养皿）。如图2A所示，10%的DMSO似乎能产生更高比例的绿色细胞。相比之下，与未处理的对照组相比，5%DMSO溶液没有导致绿色细胞的显著增加。另一方面，置于高于10%的DMSO溶液会导致绿色细胞显著减少。此外，在10%的DMSO浓度下，作者观察到亮绿色细胞的百分比最高。

　　通过将DMSO浓度控制在10%，然后改变时间。具体而言，在室温下用10%DMSO溶液孵育细胞2至15分钟。我们发现最佳孵育时间为~5分钟（图2B）。与对照组相比，较短的孵育时间（即2分钟）对绿色细胞的数量影响很小。相比之下，孵育DMSO超过5分钟会导致绿色细胞减少。这些结果（图1和图2）使作者得出结论，用10%DMSO孵育转染细胞5分钟被认为是最佳的。

　　图2：确定DMSO的最佳浓度和孵育时间。

　　DMSO孵育后GFP表达随时间的变化

　　然后，作者监测了用DMSO处理的培养皿中GFP的表达随时间的变化。具体来说，作者测量了DMSO处理和未处理培养皿中6天内绿色细胞的百分比。数据显示，与未处理的细胞（图3B）相比，在此期间，DMSO处理的细胞中GFP的表达始终较高（图3A）。此外，DMSO处理和未处理的细胞在第2天的GFP表达水平最高（图3C）。根据第2天的绿色细胞百分比，作者发现转染后4小时，用5%DMSO处理5分钟的培养皿中的绿色细胞平均增加了约1.6倍。

　　从第3天开始，两种细胞培养液的整体荧光强度逐渐降低（图3C）。作者后期在较低的33℃下培养细胞，与37℃相比，低温条件可以维持更多的细胞。事实上，未经处理的细胞在第2天后也显示出类似的绿色细胞总体百分比下降（图3C），这与作者之前报告的常规HEK-293培养液或没有DMSO处理）的观察结果一致，进一步表明DMSO短暂孵育转染的HEK-293细胞（即5分钟）不会影响细胞状态，至少不会明显影响。总的来说，从第2天开始，绿色细胞百分比的下降很可能是由于内在的蛋白质降解和/或细胞裂解。事实上，之前的一项研究报告称，GFP在哺乳动物细胞中的半衰期约为26小时。在哺乳动物细胞（如HEK-293细胞）中瞬转重组蛋白时，通常在转染后24-72小时收获细胞，因为在此期间蛋白质的表达通常会达到最高。作者观察到的（图3）属于这一时间范围。

　　图3：DMSO孵育后GFP表达的时间过程。

　　结论

　　哺乳动物细胞瞬转表达重组蛋白取决于许多因素。这些因素包括宿主细胞的类型、基因转录和翻译的速率、基因表达的稳定性、细胞中翻译后修饰以及转染效率。一旦选择了细胞系，提高转染效率可能是提高目的产物的最有效方法之一。选择HEK-293细胞做瞬转实验，这些细胞可以很容易地被操纵。基于这一想法，作者在这里研究了将DMSO短暂孵育转染细胞对瞬时蛋白表达量的影响。正如作者在这项研究中所示，在转染目的重组蛋白后4小时，将HEK-293细胞孵育于10%DMSO中5分钟，可将表达量提高约1.6倍，对细胞活率或密度没有任何不良影响。所以该方法是一种简单、有效且成本低廉的可用于提高HEK-293细胞瞬转表达量的方法。